组织芯片免疫荧光三标（四色）染色

服务介绍：　　

组织芯片的免疫荧光检测，是将许多不同个体组织标本以规则微阵列方式排布于同一载玻片上，同时进行相同指标的免疫荧光检测。组织芯片荧光三标实验室在同一张组织芯片上对三个抗原进行同时标记，从而实现定性，定位，半定量分析。 组织芯片的免疫荧光检测，标本体积小, 标本信息含量大 , 一次性实验即可获大量结果。实验条件更易控制一致，减少批间批内误差，结果更准确。

实验流程：

1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min-蒸馏水洗。

2 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复。喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3 画圈, 双氧水封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

4 血清封闭: 切片稍甩干，滴加BSA，封闭30min。（一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）

5 加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。

7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加CY3-TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

8 高压修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复，喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

9 加第二种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

10 加对应的HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加TSA，避光室温孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min

12 高压修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于高压锅内进行抗原修复，喷气计时2min30s，自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，去掉已经结合到组织上的一抗二抗，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片

13 加第三种一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

14 加CY5标记的荧光二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的CY5标记荧光二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

15 DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

16 淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。

17 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

18 切片置于扫描仪下采集图像:DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光.。CY5激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，CY5原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。