免疫荧光双标

一、免疫荧光双标染色详情介绍：

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

二、实验结果图片展示

1. 脑组织GFAP/C-FOS双标

2.肿瘤组织CD31/α-SMA双标

二、实验流程

1. 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-

无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精 5min，自来水洗；

2. 抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修

复，喷气计时 2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃

动洗涤 3 次，每次 5min；

3. BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴

加用5%BSA，室温封闭 1h；

4. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的两个种属不同的一抗，切片平放于湿盒内4°C

孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

5. 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次8min。切片稍甩

干后在圈内滴加与一抗种属对应的二抗，两个种属的颜色要区分开，覆盖组织，室温孵育 120min。之后玻片置于 PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；

6. DAPI 染核：滴加DAPI，室温孵育10min，之后玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上

晃动洗涤 3 次，每次 6min；

7. 封片：抗荧光淬灭剂封片；

8. 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI 紫外激发波长330-380nm，发射波

长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长

510-560，发射波长590nm，发红光）。

四、染色结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光和绿光。