RNA提取及反转录

服务介绍：

细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质，最终获得高纯RNA产物的过程。再在逆转录酶的催化下，随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA (complementary DNA，cDNA)。

实验流程：

取材-RNA提取-测浓度-逆转录成cDNA 

其中mRNA、lncRNA、circRNA为普通逆转录；

miRNA采取特异性逆转录(需提供基因名称和种属，方便设计引物用于特异性逆转录 )，默认做茎环法的逆转录，如需做加尾法逆转录请特别备注说明。

样本收集：

1、细胞板贴壁细胞收集：

   细胞弃培养上清，预冷PBS轻柔洗涤保证完全去除培养基。加少量预冷的PBS用细胞刮刀将细胞收集于冻存管，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

2、细胞团块收集：

细胞团块加1ml PBS重悬（注意不要过于剧烈造成细胞破裂），4℃ 1000rpm离心5分钟，弃上清，重复3次，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

3、悬浮细胞收集：

将培养完成的细胞，转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

裂解：贴壁细胞去除培养基后直接加trizol，团块和悬浮细胞在收集到细胞后加适量Trizol重悬（10^6细胞之内加1mlTrizol）。所有细胞样本在加入裂解液后需要用移液器吹打至无明显细胞残渣。

4.组织收集：取材应在冰上进行，取材后组织用生理盐水冲洗干净，去除血渍和污物，并剔除非研究所需的组织。取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久。

5.运输：使用大体积干冰运输；

6.取样量：细胞10^6以上，组织：50mg