同源双标染色介绍

一、同源免疫荧光染色技术原理及实验步骤

技术原理

  主要原理是基于酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下简称 TSA 技术。TSA 技术主要原理是利用酪胺 Tyramide 的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在 HRP 催化 H2O2下形 成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪 氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。

实验步骤

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗；

2.抗原修复：组织切片置于盛有抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

3.灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min，PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

4.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6.加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的HRP二抗覆盖组织，室温孵育50min；

7.加对应的 tsa 染料：玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加 TSA，避光室温孵育 10min. 孵育完后，玻片置于PBS 中在脱色摇床 上洗涤 3 次，每次 8min；

8.抗体洗脱：组织切片置于盛有抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，（修复液要与第一次的一致）喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

9.灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min，PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

10.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

11.加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的第二种一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

12.加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的HRP二抗覆盖组织，室温孵育50min；

13.加对应的 tsa 染料：玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加 TSA(和第一次标记的荧光颜色要区分开），避光室温孵育 10min. 孵育完后，玻片置于 PBS中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min；

14. DAPI染核：滴加 DAPI，室温孵育10min，之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

15.封片：抗荧光淬灭剂封片；

16.镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光. 647荧光激发波长 608-648nm, 发射波长672-712,，原本为正红色，为了与CY3区分开，我们设定为粉色光。 594激发波长594nm，发射波长615nm. 我们设定为紫红色）。

二、染色结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的颜色。