ELISA实验常见标本的采集处理及保存方法

  能够应用ELISA实验的样本种类很多，有血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清、尿液、肺泡灌洗液 、脑脊液、各种组织匀浆等，每种样本采集和处理的方式都不同。

一、血清

  1.采血后室温静置20min或更长的时间至血清析出。

  2.将采集的血液用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，取上清并分装保存（-20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

  3.注意事项：大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久，在间接法中可使本底加深。

二、血浆

  1.用EDTA或肝素抗凝管采集血液标本，在4 ℃条件下3000转离心20分钟或1000 g离心15分钟，取上清并分装保存（-20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

  2.注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA，抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA.

三、尿液

  采集尿液样本，加入无菌试管中，用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，收集上清，分装保存（20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

四、细胞上清

  用无菌试管手机细胞培养液，用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，收集上清，分装保存（-20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

五、细胞裂解液

  1.取细胞培养板或者细胞悬液，用PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板1-2次

  2.通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。

  3.用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，收集上清，分装保存（20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

六、组织匀浆

  1.采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除周围的结缔组织，称取组织块。

  2.用移液管量取0.1MPBS或者用0.86%冷生理盐水，称重后将组织剪碎，按1:9的质量体积比（即1 g组织加入9 mL溶液）加入PBS溶液（建议加入适量蛋白酶抑制剂）。

  3.匀浆方式：

  ①　手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再加入PBS或者生理盐水，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次，充分研碎，使组织匀浆化。

  ②　机器匀浆：用组织捣碎机10000-15000r/min上下研磨成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3-5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

 4.将制备好的10%匀浆用离心机4℃，3000rpm离心15min，将离心好后手机上清，分装保存（20 ℃或-80 ℃）备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

七、保存方法

  样本收集后如在一周内检测，可置于4 ℃保存；若不能及时检测，请按一次使用量进行小份分装，置于-20 ℃（1个月内检测）或-80 ℃（半年内检测）保存，避免反复冻融。