Westernblot实验步骤及取材注意事项

Westernblot实验步骤

1. 样本制备：蛋白提取（ripa裂解液 蛋白酶抑制剂（防止蛋白降解）） 、蛋白定量（BCA蛋白定量试剂盒）、 蛋白变性（煮沸）

2. 电泳转印：制胶（sds凝胶制备试剂盒） 电泳（溴酚蓝） 转印（PVDF膜、丽春红）

3. 封闭：（TBST  脱脂奶粉）

4. 抗体孵育：一抗（客户提供）  二抗

5. 曝光成像（ECL发光液）

WB样本收集及注意事项

样本收集

一、WB实验中组织的采集、处理和保存

1、细胞板贴壁细胞收集：

   细胞弃培养上清，预冷PBS轻柔洗涤保证完全去除培养基。加少量预冷的PBS用细胞刮刀将细胞收集于冻存管，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

2、细胞团块收集：

细胞团块加1ml PBS重悬（注意不要过于剧烈造成细胞破裂），4℃ 1000rpm离心5分钟，弃上清，重复3次，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

3、悬浮细胞收集：

将培养完成的细胞，转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

4.保存与运输

   收集并液氮速冻的细胞需要保存于-80℃冰箱，可保存3个月。

二、Westernblot实验中组织的采集、处理和保存

1.组织收集：取材应在冰上进行，取材后组织用生理盐水冲洗干净，去除血渍和污物，并剔除非研究所需的组织。取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久。

2.组织保存：取材完成后吸干水渍并切小块，放入已标记的冻存管中，液氮速冻后，转运至-80℃冰箱。

3.保存：新鲜的组织可以在-80℃冰箱保存半年左右，1年内冻存组织均可尝试进行定量WB实验；

4.运输：可以使用大体积干冰运输；

样本准备的注意事项

  1.样本量要充足：实验一定要求有足量的并且保证纯度的细胞或组织。（至少10^7的细胞或者30mg组织。）

 2.取材速度要快：取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；

3.保证无菌无酶的环境：将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；

4.做好标记：在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；

5.冻存要速度：将冻存管直接放入液氮中速冻；

6.样本的保存时间和运输环境：速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；样本运输：液氮或干冰运输

7.全血取样注意事项：全血千万不能放入干冰中送样，应室温保存，且采集完全血后，应尽快处理，从其中分离出所需的细胞或其他样本。