细胞爬片制作免疫荧光的方法

一、适用范围

   贴壁细胞爬片免疫荧光染色，适用于细胞膜 / 细胞质 / 细胞核蛋白定位检测，通用 24 孔板体系

二、提前准备（实验前）

1. 耗材预处理

   无菌圆形爬片：75% 乙醇浸泡 10min，无菌 PBS 漂洗 2 次，超净台吹干，铺入 24 孔板备用；易脱壁细胞可提前用多聚赖氨酸包被爬片

2. 细胞接种

   接种密度：1–2×10⁴个 / 孔，培养至50%–70% 细胞汇合度（抗原表达较佳、形态完好）

3. 试剂

  1.固定液：4% 多聚甲醛

  2.通透液：0.5% Triton X-100

  3.洗涤液 PBST：PBS + 0.1% Tween-20

  4.封闭液：5% BSA（PBST 配制，无 BSA 可用正常山羊血清替代）

  5.一抗

  6.荧光二抗

  7.DAPI 

三、操作流程

第一步：清洗弃液

   弃去孔内培养基，37℃预热 PBS轻柔清洗，2 次、每次 3min，彻底去除残留血清（避免背景杂质）

第二步：细胞固定（室温 15min）

  每孔加入 500μL 4% 多聚甲醛，室温静置固定 15min；

  固定结束后，PBST 清洗 3 次、每次 3min

第三步：通透处理（按需选择，核心区分）

✅ 胞浆 / 核蛋白：加入 0.5% Triton X-100，室温通透 20min，PBST 洗 3 次 ×3min

❌ 细胞膜蛋白：直接跳过通透步骤（通透会破坏膜结构，导致信号丢失）

第四步：封闭封闭（室温 40min）

  彻底吸干孔内残留液体，每孔滴加足量 5% BSA 封闭液（完全覆盖爬片）

  室温封闭 40min，无需清洗，直接孵育一抗

第五步：一抗孵育（核心步骤）

  每片滴加 50–100μL 稀释好的一抗，将孔板放入保湿湿盒（防止抗体风干）

  4℃冰箱避光孵育12–16h（过夜）

第六步：一抗洗涤（次日操作）

  取出样本恢复室温，PBST 充分洗涤，3 次、每次 5min，洗净未结合一抗（降低非特异性背景）

第七步：二抗孵育（全程避光）

  滴加稀释后的荧光二抗，湿盒内室温避光孵育 60min

  孵育完成后，PBST 洗涤 3 次、每次 5min

第八步：细胞核染色（可选）

  加入 DAPI 工作液，室温避光染色 5–10min

  弃染液，纯水轻洗 1 次（避免盐结晶影响成像）

第九步：封片保存

  1.载玻片中央滴加 15μL 抗淬灭封片液

  2.无菌弯头镊子夹取爬片，细胞面朝下，单侧缓慢放下（杜绝气泡）

  3.边缘透明指甲油密封，室温晾干 5min

  4.避光 4℃保存，1–2 周内成像较佳

四、核心禁忌 & 关键注意事项

  1.全程轻柔操作，严禁冲洗直冲爬片，防止细胞大面积脱落

  2.所有荧光二抗、DAPI 操作全程避光，避免荧光淬灭

  3.抗体孵育必须用湿盒，液体风干会产生极强非特异性背景

  4.膜蛋白绝对禁用 Triton 通透，核蛋白必须通透，不可省略

五、常见问题快速排错

  1.细胞脱落：预热 PBS 清洗、降低操作力度，敏感细胞使用包被爬片，固定时间不超时

  2.背景过高：封闭时间不低于 30min，降低抗体稀释浓度，延长 PBST 洗涤时间

  3.无特异性信号：核对抗原定位（是否错用通透）、确认抗体效价、一抗孵育时长充足

  4.荧光淬灭快：全程避光操作，必须使用抗淬灭封片液，及时密封保存