免疫荧光单标记法的步骤有哪些

免疫荧光是病理技术服务中常见的一种服务项目，免疫荧光的主要原理是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。免疫荧光分单标记法和双标记法。

免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

1、所需材料与试剂

①培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。

②一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

③4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。

④封闭液。

⑤0.01mol／LPBS缓冲液。

2、免疫荧光染色方法

①取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

②加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

③加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

④正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。

⑤去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。抗体以0.01 mo/LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

⑥0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

⑦加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

⑧0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用滤纸吸干。

⑨90%甘油(PBS配制)封片。

⑩激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。