实时荧光定量PCR的原理及应用

实时荧光定量PCR 可根据荧光染料的不同分为染料法和 TaqMan探针法两种；而根据数据分析方式又可以分为相对定量和绝对定量。这些不同的实验方法有不同的原理及应用。

1 SYBR-Green染料法：指在PCR反应体系中，加入荧光染料（SYBR-Green最为常用），进而监测荧光变化的实验方法。荧光染料SYBR-Green在游离状态不发射荧光。而在SYBR非特异性地掺入DNA双链后则发射荧光信号。从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR-Green仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

SYBR-Green染料法的优势在于方便快捷，无需探针故成本较低，但是对引物特异性要求较高，检测灵敏度相对较低。其结果多用于进行相对定量分析。

2 TaqMan探针法：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

Taq-Man探针法的优势在于特异性较高，重复性好，但是探针只能针对一个特定序列，且探针价格较高。这种技术可以用于检测基因突变检测进而进行遗传病筛查，癌症诊断及药物靶点筛选。结果多用于绝对定量。

1相对定量

分析特定样品相对于参考样品某个基因表达量的变化。主要在科研中使用，测量基因表达对各种处理（加药、造模、基因过表达、RNA干扰等）的应答。

2绝对定量

使用标准样品制作标准回归曲线，利用线性回归的方法进行绝对定量时，可以基于已知数量对未知数量进行定量。主要在临床检测中使用，将病毒拷贝数与疾病状态建立关联。并进行基因突变检测（可用于转基因食品检测、遗传病筛查、癌症早期诊断、靶向药靶点筛选）。