透射电镜问题详解

一，透射电镜介绍

      透射电子显微镜(Transmission electron microscope，缩写TEM)，简称透射电镜 ，是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像，影像将在放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、以及感光耦合组件)上显示出来。透射电镜可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构，最小分辨率0.2nm。

二，透射电镜取材要点

快-由于组织离体后，细胞缺氧导致溶酶体破裂而释放大量水解酶，造成组织结构的迅速降解，产生自溶现象。为了尽量保持样品的生活状态，将自溶的程度降到最低，从还有心跳与呼吸的动物体上取下样品后，组织块要争取在30秒内浸入固定液。

小-电镜所用固定剂穿透力较弱，为了与固定液的穿透速率相适应，样品块的大小不得超过0.5～1mm3以确保固定效果。

冷-为了降低组织和细胞内各种酶的活性，减缓细胞自溶的过程，要求在低温（0～4℃）下操作，所用固定液和器械应预冷，所有样品送样前，在固定液中浸泡不超过一周。4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

准-由于电镜观察范围有限，要求取材时尽量精确到需要观察的目的部位，然后在同一个部位取3～5块样品。（如观察肾小球取肾皮质；观察胰岛取胰岛丰富的胰尾；皮肤，肠胃等在固定液中易打卷的组织可将组织粘在滤纸上进行固定）。

轻-取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织。在取材过程中，由于刀片不锋利或者操作不仔细，对样品产生牵拉、挤压等现象所造成的人工损伤都将导致其细胞结构的严重变化，因此在整个取材过程中自始至终动作要小心，器械要锋利。

三，负染

      负染，也称阴性反差染色，在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，负染色也称负反差染色，金属盐在标本外周形成电子不能穿透的包围层，而标本本身相对通过较多的电子，在电镜下比较浅淡，与周围的深暗背景形成反差，主要用于颗粒悬滴样本如外泌体、病毒、脂质体、纳米材料的样品制备。两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

   主要用于颗粒悬滴标本如外泌体、病毒、噬菌体、细菌、分离细胞器及某些大分子材料等低密度样品的超微结构观察。目前常用的负染液：磷钨酸，磷钨酸钾，磷钨酸钠。磷钨酸、磷钨酸钠、磷钨酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1％～3％的溶液，使用时应用1 mol／L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4～7.0或实验所需的值。

  影响负染效果的因素:样品的纯度：如果杂质太多，会干扰染色反应和电镜的观察。样品的浓度：太稀时在电镜下寻找样品将很困难;太浓时，样品的堆集会影响观察。染液PH：负染色在制备过程中只要pH值有微小的变化就可能产生不同的形象，有时不仅不能获得良好的负反差，相反会出现正染色的效果，不同的样品要求的pH值也不尽相同。染色的时机：滴染液的时机一般既不要在生物样品完全干了之后，更不应在载网上尚有肉眼可见的水珠时就着手染色。恰当的时机应是用滤纸吸去悬液之后稍待片刻，当肉眼看不出残留的液体时滴加染色液。如果载网上尚有悬液残存时就进行染色，或者完全干后再染色，效果都不佳。

四，实验当中的常见问题

1，为什么要及时固定？

  固定的目的是利用物理或者化学的方法，使组织尽可能保存接近生命状态的结构，固定细胞内的各种成分，避免死后自身酶分解出现自溶，或外界微生物侵入繁殖导致细胞的超微结构受到破坏；而电镜固定液的主要成分是戊二醛，它对糖原、核蛋白、微管、内质网等膜系统和细胞基质均有较好的固定作用。

2 ，冷冻过的样本还可以做电镜吗？

冷冻过的样本不能做电镜了，冷冻后组织内部会产生冰晶破坏超微结构，或组织会出现空洞的情况，需要重新准备样本并及时固定。

3， 半薄切片和超薄切片的厚度分别是多少？

  半薄切片是将树脂包埋的样本进行切片，厚度一般为1.5um左右，用防脱玻片进行捞片，主要用来为超薄切片定位或观察显微结构；超薄切片是将树脂包埋的样本进行切片，厚度一般为50~80nm左右，采用无碳芳华膜铜网捞片，重金属染色。

4， 电镜结果的照片不清楚是为什么？

   照片不清楚是因为组织细节丢失，所以很模糊，导致细节丢失的原因可能是：组织未及时固定，组织出现了自溶；组织块取材时候太大，或者质地比较致密，固定液未及时渗透；部分组织区域出现了病变导致。

5 ,为什么磁性材料不能做电镜？

 磁性材料会导致电子束偏转，对电镜造成损伤，故带有磁性的材料无法做电镜实验。

6 ,半薄切片能做哪些染色？

甲苯胺蓝染色

7 ,为什么你给的图和参考文献的图倍数、标尺不一样？

  不同电镜厂家，同厂家不同型号 其成像CCD均有差异，故而倍数和标尺只做参考，具体以图片显示效果为参考灵活调整。

8 ,透射电镜图片分辨率多大？

   322dpi

9, 透射电镜实验中负染是什么？

    负染色也称负反差染色，金属盐在标本外周形成电子不能穿透的包围层，而标本本身相对通过较多的电子，在电镜下比较浅淡，与周围的深暗背景形成反差，主要用于颗粒悬滴样本如外泌体、病毒、脂质体、纳米材料的样品制备。

10, 透射电镜照片中标注有哪些信息？分别代表什么意思？

   透射电镜照片在拍照过程中，系统都会自动生成相关信息，显示在照片的左下角；其中x-k代表放大倍数，一个标尺的可能对应几个倍数，Zoom代表系统预设变焦方案，HC代表高反差模式（HR代表高分辨模式），kV代表加速电压，Hitachi TEM system代表所使用的日立透射电镜系统。x200～x200,000 (HC)；x4000～x600,000 (HR）