石蜡切片多重免疫荧光技术

在临床病理和基础科研中，往往有在同一组织样本玻片上进行多个蛋白靶标或生物标志物的检测需求，进而对多个靶标蛋白的表达分布、表达水平以及组织结构进行可视化观察，以实现多靶标表达信号的共定位，目前这种检测可通过多重荧光免疫组化（multiplex immunohistochemistry，mIHC）技术实现。

多重免疫组化技术原理

酪酰胺信号放大(TSA)技术是一类利用辣根过氧化酶 （HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采多聚HRP的二抗， 同样有对应的“显色”步骤，HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-HRP二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

特点

由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗、二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验。 

完美解决荧光双染中一抗来源需不同种属。 

信号放大，荧光信号放大的倍数大大增强。 

可以对多种蛋白在同一张切片上进行不同荧光标记，实现多种蛋白共定位。

实验步骤：

注意事项

① 多重荧光免疫组化实验操作过程中，需保持切片处于湿润状态，避免干燥；

② 修复液需预热至修复温度，修复过程中切片组织要完全浸入修复液中，修复完成后避免快速降温；

③ 修复液可根据待测一抗生产厂家的推荐使用，也可根据实验需求自行选择修复液，对于抗原修复比较难做出的情况下，抗原修复液pH值和修复时间可适当加强；

④ 若手工实验操作，免疫组化笔画疏水边界时要稍微大些，避免组化笔中液体沾到组织；

⑤ 封片时选择含抗猝灭的水溶性封片剂。

实验可以扫描的荧光通道

实验结果图片