磷酸化蛋白样品做Western Blot

磷酸化蛋白样品处理

   迅速取样与低温操作：磷酸化反应迅速，因此取样需迅速，样品需新鲜。所有操作最好在冰上进行，以缩短处理时间。处理细胞时，要使用4℃预冷的PBS洗涤细胞，对于组织则采用液氮研磨，研磨器具需预冷。

   裂解液配制：提取磷酸化蛋白裂解液需新鲜配制，需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如okadaic acid, NaF）。另外需要根据特定磷酸化位点（如酪氨酸）添加特定抑制剂（如sodium vanidate）。

   样品保存：提取后立即变性，并于-80℃分装保存，避免反复冻溶导致磷酸基团降解。

Western Blot操作要点

   上样量：磷酸化蛋白表达丰度低，一般只有总蛋白量的10%，需确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。

   内参：磷酸化蛋白检测需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平发生变化了；另一个是普通内参比如actin和GAPDH，保证上样量一致从而排除体系本身的影响。

   防止脱磷酸化：在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂（如Na3VO4）。抗体选择：磷酸化抗体的质量至关重要，选择信誉好的厂商。因为磷酸化蛋白丰度低，一抗最好4℃过夜，保证充分结合，二抗室温孵育1小时。

   洗涤与孵育：洗涤时摇床转速不宜过快，时间不宜过长，每次5分钟，共3次。避免多张膜叠在一起洗涤。

Western Blot时背景与条带问题

   压片：时间需适当，避免背景过深或过浅。对比TBST洗涤的膜，密理博（millipore  ）最近的说明书推荐使用双蒸水洗涤，可有效降低背景。磷酸化蛋白WB时，除了目的条带，常常出现非特异性条带，因些，压片后要事实上要根据Markers比对条带分子量。 

   总蛋白表达量：研究磷酸化情况后，常常需要研究对应的总蛋白表达量。推荐使用strip液洗去已结合抗体，再用同一张膜压总蛋白和内标。