冰冻切片免疫组化染色实验步骤

1实验原理

   抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

2冰冻切片免疫组化染色实验步骤

1. 复温，水洗：将切片从-20℃拿出来复温30min，蒸馏水洗两次，每次8min；

2. 固定：将切片至于4%的多聚甲醛中固定15min，用PBS洗3次，每次5min；

3. 阻断内源性过氧化物酶：切片放入0.3%甲醇过氧化氢溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

4. BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5. 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6. 加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加对应一抗种属的HRP二抗，覆盖组织，室温孵育 60min；

7.  DAB 显色：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min，切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色， 自来水冲洗切片终止显色；

8. 复染细胞核：Harris 苏木素复染 3min 左右（冰冻切片可缩短时间），自来水洗，分化液分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝；

9.  脱水封片：将切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

10. 显微镜镜检，图像采集分析。

染色结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的阳性表达为棕黄色。