免疫组化染色中非特异性染色着色的原因

免疫组化中非特异表达的常见原因可分为4类，核心是抗体结合异常或操作/组织本身干扰，具体如下：

1. 抗体相关因素

- 抗体特异性低：抗体与组织中非目标抗原存在交叉反应（如多克隆抗体因识别多个抗原表位，比单克隆抗体更易出现此问题）。

- 抗体浓度过高：过量抗体未结合目标抗原，游离部分非特异性吸附在组织上。

- 抗体保存/处理不当：抗体反复冻融、过期或污染，导致其结构改变，失去特异性结合能力。

2. 组织与样本处理因素

- 组织固定不充分/过度：固定不充分导致抗原弥散，过度则使抗原表位被破坏，均可能让抗体非特异结合。

- 组织中存在内源性物质：如内源性过氧化物酶（红细胞、粒细胞中丰富）、生物素（肝、肾组织中较多），会与检测系统中的对应成分反应，产生假阳性。

- 样本污染：切片过程中交叉污染（如不同样本的组织碎屑残留），导致无关抗原被检测。

3. 染色操作因素

- 孵育条件不当：孵育温度过高（如超过37℃）、时间过长，加速抗体非特异结合。

- 洗涤不充分：未彻底洗去未结合的抗体或试剂，残留部分在后续步骤中显色。

- 封闭步骤缺失/不充分：未用封闭液（如BSA、正常血清）阻断组织表面的非特异结合位点，导致抗体直接吸附。

 4. 检测系统因素

- 酶标二抗交叉反应：二抗与组织中其他物种的免疫球蛋白结合（如检测小鼠抗原时，二抗与组织中的人IgG反应）。

- 底物显色时间过长：底物反应过度，即使微弱的非特异信号也会被放大，形成假阳性。