在实验过程中，多靶点原位检测、低丰度功能蛋白验证通常是比较麻烦的传统IF、IHC技术灵敏度有限，难以准确捕捉低表达靶蛋白，易出现信号微弱、背景杂乱、假阴性等问题。除此之外，传统多色免疫荧光对抗体种属要求严苛，多指标检测必须搭配不同种属一抗。但我们常用的靶点抗体多集中为兔源、鼠源，极易出现种属冲突，大幅增加抗体筛选难度，很多多通路、多靶点验证实验会因此受限，被迫删减指标、调整研究方案。
这时候就出现了一种技术TSA多重免疫荧光技术，那么什么是TSA多重免疫荧光技术，我们该如何去使用呢，今天我们就一起来看看吧。
1.什么是TSA多重免疫荧光技术
TSA实验全程：酪胺信号放大的多重免疫荧光技术（TSA ，Tyramide signal amplification），是现阶段生物医学领域高精度原位检测的核心技术。
核心原理：可以概括为三个部分①酶催化共价沉积 + ②信号放大 + ③抗体洗脱循环
①酶催化共价沉积
一抗结合靶抗原后，加入HRP标记的二抗，随后加入含荧光基团的酪胺底物与过氧化氢。HRP催化过氧化氢产生活性氧，使酪胺分子转化为高活性自由基，这些自由基迅速与邻近蛋白质（主要是酪氨酸残基）发生共价结合，将荧光信号牢固沉积在抗原位点周围。
②信号放大
由于一个HRP分子可催化成百上千个酪胺分子沉积，且酪胺自由基扩散范围极小，该技术实现了比传统免疫荧光高10–100倍的信号放大效率，同时保持较高的空间分辨率，特别适用于低丰度抗原的检测。
③抗体洗脱循环
完成一轮染色后，通过微波加热或酸性/碱性处理将抗体复合物洗脱，但共价结合的荧光信号因与组织牢固结合而得以保留。随后即可换用同种属来源的另一靶标一抗或者不同种属的靶标一抗，重复上述过程进行下一轮TSA染色。这种"抗体洗脱、信号保留"的循环突破了传统免疫荧光中二抗种属交叉反应的限制，使同一张切片上可叠加4–7种甚至更多不同颜色的荧光标记。
2.优点
节约珍贵组织样本
动物取材、临床标本有限，不用连续多张切片分别染色，一张切片完成多指标检测，避免连续切片带来的细胞位置错位。
保留原位空间信息（最大优势）
可以直接看到不同细胞互相的位置关系：比如肿瘤细胞、CD8⁺T细胞、Treg、巨噬细胞在组织里的排布、距离，分析免疫微环境，而不是单纯拿到阳性率数值。
光谱拆分，减少荧光串色
依托光谱成像，区分发射光谱重叠的荧光信号，解决普通荧光多标容易串色的痛点，结果更可靠，适合同源一抗TSA方案。
可同时做多指标定量
扫描后可通过软件圈门，统计各类细胞数量、阳性比例、细胞间距离、共定位系数，适合免疫评分、冷热肿瘤、细胞互作研究。
适合复杂机制研究
肿瘤微环境、神经细胞分型、炎症浸润、纤维化、器官损伤等，适合解析多种细胞亚群共存的复杂组织。
3.实验流程（同源双标三色流程为例）
1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，蒸馏水洗；
2.抗原修复：组织切片置于盛有抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；
3.灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min，PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；
4.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；
5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；
6.加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的HRP二抗覆盖组织，室温孵育50min；
7.加对应的 tsa 染料：玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加 TSA，避光室温孵育 10min. 孵育完后，玻片置于PBS 中在脱色摇床 上洗涤 3 次，每次 8min；
8.抗体洗脱：组织切片置于盛有抗原修复液的容器内95℃ 洗脱15min；自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；
9.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；
10.加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的第二种一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；
11.加对应HRP标记的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次8min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属标记的HRP二抗覆盖组织，室温孵育50min；
12.加对应的 tsa 染料：玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加 TSA(和第一次标记的荧光颜色要区分开），避光室温孵育 10min. 孵育完后，玻片置于 PBS中在脱色摇床上洗涤 3 次，每次 8min；
13. DAPI染核：滴加 DAPI，室温孵育10min，之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；
14.封片：抗荧光淬灭剂封片；
咨询热线：13572593771
