细胞爬片的实验步骤和注意事项

爬片的准备

1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；

2.将盖玻片剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时用小沙轮轻划一下，稍用力掰开。如接种大皿，请不要将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，待染色时再切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做多个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，次日用自来水冲20遍，置于无水酒精中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（主要目的是将酸冲洗干净，以免影响细胞贴壁效果），置于玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压消毒后取出放入烤箱中烤干，放入超净台备用。

细胞爬片制作

1.胰酶消化细胞后，计数重悬细胞于完全培养基中。

2.根据玻片的大小加入细胞，向每孔中预留的放置爬片的位置处滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿粘合到一起，然后放入玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。

3.根据需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

4.待细胞贴壁后，去上清，加含药培养基。

5.按照实验设计，一段时间后取出玻片。取玻片时，将注射器针尖向背面弯曲，将爬片轻轻勾起，用小镊子取出。

6.将所需数量的爬片取出时，应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可继续培养。

细胞爬片的固定

1.细胞爬片取出后，用PBS洗2遍再做固定（此步骤可根据研究目的做取舍，比如做凋亡细胞染色时可免洗，凋亡的细胞在清洗的过程中有可能脱落）。

2.用培养皿保存细胞爬片。在皿底放一层面巾纸，再放爬片，（方便取片）。然后盖上盖子，做好标记，用透明胶带将盖子和皿连在一起，-20℃保存。

3.放-20℃保存之前，吸干培养基或PBS，-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。

以下为常用的固定液（按需选择）

1.冷丙酮：可用于一般的免疫组化染色。

将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胞分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

室温固定15分钟后，将表面液体吹干，-20℃保存

3. 95％乙醇，可用于免疫组化。

优点：穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间胶长，抗原会流失而减弱反应强度。

室温固定15分钟后，将表面液体吹干，-20℃保存

4. 甲醛(福尔马林)应用最广

优点：形态结构保存好，且穿透性强，

缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。