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PCR样本采集及保存

发布日期:2023/3/23 15:43:00来源:http://www.sxyksw.com/news926268.html

详细介绍


一、PCR 实验中细胞的采集、处理和保存

1.细胞板贴壁细胞收集:

细胞弃培养上清,预冷PBS轻柔洗涤保证完全去除培养基。加少量预冷的PBS用细胞刮刀将细胞收集于冻存管,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。

2.细胞团块收集:

细胞团块加1ml PBS重悬(注意不要过于剧烈造成细胞破裂),4℃ 1000rpm离心5分钟,弃上清,重复3次,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。

3.悬浮细胞收集:

将培养完成的细胞,转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞,置于液氮速冻。

4.细胞收集后的裂解方法:

贴壁细胞去除培养基后直接加trizol,团块和悬浮细胞在收集到细胞后加适量Trizol重悬(10^6细胞之内加1mlTrizol)。所有细胞样本在加入裂解液后需要用移液器吹打至无明显细胞残渣。

5.保存与运输

① 收集并液氮速冻的细胞需要保存于-80℃冰箱,可保存1个月。

② 裂解的细胞将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解),-20℃下,可放置保存1个月; -80℃下,可放置保存6个月;

注:没有裂解液的情况下需要收集细胞后速冻保存细胞;有裂解液则直接裂解细胞。(Trizol裂解液中含有RNA酶抑制剂,有利于RNA的保存。)

二、PCR 实验中组织的采集、处理和保存

1、组织收集:取材应在冰上进行,取材后组织用生理盐水冲洗干净,去除血渍和污物,并剔除非研究所需的组织。取动物的组织,动作要求迅速,尽量避免样本在环境中暴露太久。

2、组织保存:取材完成后吸干水渍并切小块,放入已标记的冻存管中,液氮速冻后,转运至-80℃冰箱。新鲜的组织可以在-80℃冰箱保存半年左右,3年内冻存组织均可尝试进行定量PCR实验;

3、运输:使用大体积干冰运输保证温度较低。

三、qPCR样本制备的注意事项

 1、样本量要充足: 足量的并且保证纯度的细胞(10^7个)或组织(30mg)

2、取材要速度:取动物的组织,动作要求迅速,尽量避免样本在环境中暴露太久;

3、保证无菌环境:将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中,为保证质量,推荐选取Axygen,corning,nunc等品牌的冻存管;

4、做好标记:在冻存管上做好标记,尽量清晰易辨;在实验记录本上做好记录,尽量详细易查;

5、取材完要速冻:可将冻存管直接放入液氮中速冻;或加入1ml Trizol 到冻存管中,再放入液氮速冻;

6、保存温度及时间:速冻2h 后,将冻存管从液氮转至-80度冰箱,可以保存6个月左右;

7、PCR的样本尽早的提取RNA: 尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA,因为即使冻存,降解仍然存在。

8、样本运输:液氮或干冰运输

9、全血不能放入干冰中送样(冻融会使得血细胞裂解),应室温保存,且采集完全血后,需要尽快处理,从其中分离出所需的淋巴细胞,分离出的淋巴细胞即可按照正常培养的细胞进行处理。


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