PCR样本采集及保存

一、PCR 实验中细胞的采集、处理和保存

1.细胞板贴壁细胞收集：

细胞弃培养上清，预冷PBS轻柔洗涤保证完全去除培养基。加少量预冷的PBS用细胞刮刀将细胞收集于冻存管，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

2.细胞团块收集：

细胞团块加1ml PBS重悬（注意不要过于剧烈造成细胞破裂），4℃ 1000rpm离心5分钟，弃上清，重复3次，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

3.悬浮细胞收集：

将培养完成的细胞，转移至EP管，1000rpm离心5分钟，弃上清，4℃1500rpm离心去除上清后得到细胞，置于液氮速冻。

4.细胞收集后的裂解方法：

贴壁细胞去除培养基后直接加trizol，团块和悬浮细胞在收集到细胞后加适量Trizol重悬（10^6细胞之内加1mlTrizol）。所有细胞样本在加入裂解液后需要用移液器吹打至无明显细胞残渣。

5.保存与运输

①　收集并液氮速冻的细胞需要保存于-80℃冰箱，可保存1个月。

②　裂解的细胞将细胞放入冰箱冻存（不应反复冻融，否则会使RNA降解），-20℃下，可放置保存1个月； -80℃下，可放置保存6个月；

注：没有裂解液的情况下需要收集细胞后速冻保存细胞；有裂解液则直接裂解细胞。（Trizol裂解液中含有RNA酶抑制剂，有利于RNA的保存。）

二、PCR 实验中组织的采集、处理和保存

1、组织收集：取材应在冰上进行，取材后组织用生理盐水冲洗干净，去除血渍和污物，并剔除非研究所需的组织。取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久。

2、组织保存：取材完成后吸干水渍并切小块，放入已标记的冻存管中，液氮速冻后，转运至-80℃冰箱。新鲜的组织可以在-80℃冰箱保存半年左右，3年内冻存组织均可尝试进行定量PCR实验；

3、运输：使用大体积干冰运输保证温度较低。

三、qPCR样本制备的注意事项

 1、样本量要充足: 足量的并且保证纯度的细胞（10^7个）或组织（30mg）

2、取材要速度：取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；

3、保证无菌环境：将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等品牌的冻存管；

4、做好标记：在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；

5、取材完要速冻：可将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；

6、保存温度及时间：速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；

7、PCR的样本尽早的提取RNA: 尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA，因为即使冻存，降解仍然存在。

8、样本运输：液氮或干冰运输

9、全血不能放入干冰中送样（冻融会使得血细胞裂解），应室温保存，且采集完全血后，需要尽快处理，从其中分离出所需的淋巴细胞，分离出的淋巴细胞即可按照正常培养的细胞进行处理。