免疫荧光实验步骤及注意事项

免疫荧光（IF）

免疫荧光（IF）是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项检测技术。可用于检测和识别细胞和组织中蛋白质及其他分子的亚细胞分布和迁移。

相比传统的免疫组织化学（IHC）或免疫细胞化学（ICC）的显色标记方法，IF提供了一种替代方案。通过使用多种标记物的二级抗体，IF可以研究感兴趣蛋白质的共定位，这是传统IHC或ICC无法实现的。这种技术的一个优势是能够同时分析多个目标蛋白质，从而产生大量准确的亚细胞定位数据。

一、免疫荧光步骤：

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗；

2.抗原修复：组织切片置于盛有柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

3.灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min，PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

4.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6.加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min。切片稍甩干后在圈内滴加与种属对应的荧光二抗，覆盖组织，室温孵育120min。之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；

7. DAPI染核：滴加 DAPI，室温孵育10min，之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 6min；

8.封片：抗荧光淬灭剂封片；

9.镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。

染色结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

二、注意事项：

1、设置对照：可以使用阳性和阴性对照来确定结果的准确性，并帮助确定任何问题的来源。

2、样品和试剂的存储：由于IF中所用抗体和实验样品的荧光性质，因此必须适当存储。最好将荧光抗体和经过IF处理的样品都保存在完全黑暗的环境中。使用琥珀色或铝箔覆盖抗体管。

3、使用适当的固定剂：醛可用于标记膜结合抗原或细胞骨架抗原，并应用于核蛋白或线粒体蛋白。醛固定后的样本需要抗原修复和打孔渗透步骤才能正确检测抗原。如果使用单克隆抗体推荐有机溶剂用于组织固定。甲醇适用于冷冻样本的固定；丙酮固定对组织学保存效果较好。

4、仔细选择抗体：应检查所有抗体，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，以确保与目标抗原具有高的亲和力。所用的二抗必须与一抗兼容，比如使用抗小鼠二抗检测小鼠来源的一抗。

5、多色染色：最好使用在不同物种中产生的一抗。如果使用间接检测，请使用已预先吸附在检测其他蛋白质的一抗和二抗的种属以及实验样品的物种中的二抗。这样可以最大程度地减少跨物种的反应性和非特异性结合。所有二抗也应在同一物种中产生，以最大程度地减少交叉反应。

一旦确定抗体特异性，就可以同时或依次将目标抗原与其抗体孵育，顺序孵育往往会产生更好的结果。对于亚细胞靶标的共定位或复染色，请选择对细胞器标记特异的抗体。

6、决定直接或间接染色：两种方法都有优点和缺点，根据实验需求选择。使用这两种方法，都应该确保充足的洗涤以最小化非特异性的结合。

7、选择没有光谱重叠的荧光团：IF是一种很好的多路复用分析技术，测量如此多的参数，那么使用能够提供可分辨信号的荧光团是很有必要的。