免疫荧光染色注意事项

1.组织固定

取材完，组织要及时固定，固定液是组织体积的10倍，容器体积要大一些，防止组织收到挤压，固定时间24-48小时，特别大的组织可以延长固定的时间；

2.切片方面

石蜡切片的质量直接关系到免疫荧光的染色效果。

因此，石蜡切片最好交由技术熟练的人员操作，新手可能会存在即便将切片机调整至3 μm但实际厚度远大于3 μm的情况，从而导致切片太厚，细胞层叠，影响观察。亦有可能因技术不熟练而破坏组织结构，影响实验效果；

3、实验过程中

①在进行抗原修复时，要尽量使抗原修复液没过载玻片，以防加热过程中过度挥发导致干片;同样，在其他操作时也因避免干片现象出现，否则可能会造成高背景及非特异性标记；

②使用组化笔画圈时，最好离组织稍微远一点，否则组化笔中的物质也有可能附着在组织上，影响染色效果。该操作主要是起到一个阻隔的作用，主要目的是防止液体外溢。在画圈时需要注意稍微等组化圈干一会儿再进行滴加所需物质，且最好多画几次以防液体外溢，孵育过程中也要时不时进行观察，以防干片；

③荧光二抗的保存以及孵育荧光二抗之后的所有操作均需避光操作，以防荧光猝灭；

④进行图片采集时，荧光物质受到激发光激发后会猝灭，因此最好先在明场下找好准备采集的视野后再切换到暗场。对于显微镜的选择荧光显微镜和共聚焦显微镜均可，通常共聚焦显微镜拍得会更清楚，但在参数调整合适的情况下，荧光显微镜拍摄足以满足日常的拍摄需要，也可以进行全片扫描可以长期保存。