WB实验流程主要步骤

一、蛋白提取：

1.明确所检测目的蛋白的表达情况，了解所研究蛋白的特点，正确选择和处理样本。

2.蛋白提取是WB实验的开端，裂解液的选择、样本的破碎方法、温度和变性等都会影响样本蛋白是否提取成功。

3.蛋白提取整个过程都需严格在冰上操作，以减少高温造成的蛋白降解；若是磷酸化蛋白检测，提取液中需加磷酸酶抑制剂混合物。

二、蛋白质浓度测定：

1.取少量裂解液，用于蛋白质定量分析。

2.使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。BCA法的原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu²⁺生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA试剂可敏感特异地与Cu¹⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物。

3.根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。

三、SDS-PAGE凝胶电泳：

1.准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶，通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。

2.将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。

3.将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。

4.设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。

四、蛋白质转印：

1.准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。

2.将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。

3.将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。

五、阻塞：

将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。

六、加入第一抗体，孵育过夜。

七、洗涤。

八、二抗孵育：二抗与第一抗体结合，形成复合物。

九、洗涤。

以上步骤完成后，可以通过显影等方法检测和分析实验结果。请注意，WB实验需要严格的操作和精确的控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。同时，实验过程中需要注意各种潜在的干扰因素，如温度、pH值、离子浓度等，以避免对实验结果产生不良影响。