WB实验及注意事项

一、配胶

注意事项

1、需留意配胶试剂的有效期和清澈度，一旦发现沉淀或结晶，要及时更换。

2、需注意pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl可能会产生沉淀，根据需要选择1.0M或1.5M的浓度。在低温下（4度以下）存放的10%SDS易结晶。30%丙烯酰胺需在避光的情况下存放在4度以下。APS具有活性，室温下容易失效，建议配制后分装并冷冻保存在-20度的冰箱中。TEMED有刺鼻的气味和挥发性，对神经有毒，使用时请在通风良好的环境下，并避免暴露在空气中。

3、插梳子时，可斜着插，以避免有气泡的产生。

4、注意防止胶条老化和干燥，注意电泳结束后，将胶条放置在实验台上晾干，以确保其干燥。若胶条老化、出现裂纹，可以在上面放置保鲜膜进行保护，这样不仅可以有效防止胶液泄漏，还可以延缓胶条老化。

5、胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

二、电泳阶段

注意事项

1、确保上样体积一致，以免蛋白条带出现不同水平。空置的加样孔需添加相等体积的1×loading buffer，避免相邻通道蛋白样品扩散。在上样过程中，缓慢添加样品，避免快速吹打导致溢出，且上样体积应小于上样孔的总容积。

2、电泳液应在内槽填满，外槽填至1/4处。1.0mm厚的玻璃板最多可点样20μL，1.5mm厚的可点样40uL。

3、根据温度选择浓缩胶的电压，夏季室温较高时电压应较低，冬季相反。分离胶固定电压为150V高电压。调节电压时间可参考marker，若marker分开，表示蛋白已进入分离胶。夏季温度较高时，应将电泳槽放入冰水中降温，以防止凝胶变形。