细胞免疫荧光染色关键要点

一、爬片制备（基础，很容易忽略）

盖玻片提前处理：多聚赖氨酸包被，促进细胞贴牢，防止后续漂洗冲掉细胞

细胞密度：不要太密，70%–80%汇合度最好；太密细胞堆叠，分不清边界、共定位难观察

种板后让细胞充分贴壁，不要刚贴上就固定

二、固定（重中之重，决定抗原+形态）

常用两种：

4%多聚甲醛（PFA，最推荐）：温和，兼顾形态和多数抗原；室温10–15 min；适合绝大多数核、浆、膜抗原

丙酮/甲醇（-20℃，5–10 min）：穿透强，适合部分膜抗原、骨架；缺点：容易破坏细胞形态、部分抗原丢失

⚠️ 禁忌：固定太久抗原容易交联遮蔽；固定液要预冷/新鲜配制，不要反复冻融

✅ 固定完PBS洗3次，每次3–5 min

三、通透（Triton X‑100，按需选择！高频考点）

检测胞内抗原、核抗原、细胞骨架（鬼笔环肽）：需要通透，0.1%~0.2% Triton X‑100，室温5–10 min，打孔让抗体进去

只检测细胞膜表面抗原：不通透！ 通透会破坏细胞膜、膜抗原弥散

四、封闭（减少非特异结合，降低假阳性）

封闭液：5% BSA 或者和二抗同源的正常血清，室温封闭30–60 min

✅ 目的：封闭细胞表面带电位点，减少抗体非特异吸附

❌ 不要用含叠氮钠的封闭液（部分荧光二抗受影响）

封闭之后不要洗干！ 直接吸掉封闭液，加一抗

五、抗体孵育（核心）

一抗稀释：严格按说明书，宁低勿高；浓度太高极易非特异背景

孵育条件：优先 4℃过夜（效果更干净）；37℃ 1–2 h速度快，但背景更容易高

孵育方式：湿盒！绝对不能干片，一干就会大片非特异荧光、报废

洗涤：PBS充分漂洗，3次×5 min，轻柔，不要直冲细胞面

二抗：全程避光！

二抗种属匹配

二抗也要优化浓度，过高背景爆炸

室温避光孵育 30–60 min，之后PBS洗

六、复染核（DAPI/Hoechst）

DAPI工作液避光染核 3–5 min，PBS洗去多余染料；

👉 作用：定位细胞核，方便判断细胞位置、共定位；就是你前面细胞结构图里的核标记

七、封片（防淬灭是IF最大痛点）

✅ 必须用抗荧光淬灭封片剂，不加的话荧光很快衰减，拍完就没了

盖玻片轻盖，避免气泡；气泡位置无法拍照；指甲油封边（长期保存）

八、镜检与保存

封好尽快拍照；避光4℃短期放，不建议长期存放

拍照参数统一：激发光强度、曝光时间不要过度，避免过曝伪影

区分：自发荧光（脂滴、某些细胞器）、非特异荧光、真实信号

九、常见坑

干片 → 强非特异荧光（很难区分真假）

通透选错：膜抗原加Triton → 膜弥散、轮廓消失

抗体浓度过高、湿盒失效

光源长时间照射 → 光淬灭

二抗交叉反应，阴性对照没做（一定要设阴性对照：不加一抗，只加二抗）