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发布日期:2023/2/10 9:18:00来源:http://www.sxyksw.com/news913617.html
灌注取材
灌注的必要性:
①脑组织较软,且细胞成分不易保留,脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富,所以最好是在取脑组织前用4%多聚甲醛灌注固定;
②经前固定后,取脑操作时,可减少脑组织损伤;
③脑内血液丰富,经灌注后,可去除红细胞。
灌注方法:心脏灌注法和夹闭腹主动脉灌注法
心脏灌注原理:心脏灌注术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。
心脏灌注方法:先把动物麻醉沿胸骨柄剪开胸腔,剪开心包膜,暴露心脏,与心尖呈30-45°夹角剪开左心室,再剪开右心耳,将灌注针从左心室插入主动脉,固定针头,然后快速用生理盐水(大鼠100-150ml)冲洗血液,至流出液体血色较浅基本澄清(肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排除血液的有效观察标志),再先快后慢注入4%多聚甲醛250ml(大鼠)固定,先后所需50min,多聚甲醛进入大鼠体内,大鼠会出现四肢、尾的抽搐,最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。然后取材,取完后的脑组织再放置4%多聚甲醛中4度冰箱进行后固定,时间大于2小时,最好过夜。
省时省剂的灌注方法
夹闭腹主动脉:只灌注上肢及头脑,固定的好又快,又节省试剂。先灌注生理盐水约100ml(大鼠),见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛,多聚甲醛100ml以下即可。
灌注成功的标志:刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动(下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全);前肢及颈部僵硬;所灌注的脑组织白而硬。
位置要求:常切的位置有前额叶皮层、纹状体、海马、下丘脑、黑质、小脑
包埋切片:
①如做冰冻切片,先蔗糖脱水,待组织沉底,即可做OCT包埋切片,切片-20℃保存;
②如做石蜡切片,酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片,切片常温保存,如果后期做免疫实验,封蜡4℃保存;
染色:
脑组织常做的染色及指标:HE、尼氏、LFB 、GFAP、iba-1、NEUN、TH、c-fos。
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