脑组织实验前处理方法及常做的染色

灌注取材

灌注的必要性：

①脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4%多聚甲醛灌注固定；

②经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；

③脑内血液丰富，经灌注后，可去除红细胞。

灌注方法：心脏灌注法和夹闭腹主动脉灌注法

心脏灌注原理：心脏灌注术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法。

心脏灌注方法：先把动物麻醉沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，与心尖呈30-45°夹角剪开左心室，再剪开右心耳，将灌注针从左心室插入主动脉，固定针头，然后快速用生理盐水（大鼠100-150ml）冲洗血液，至流出液体血色较浅基本澄清（肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排除血液的有效观察标志），再先快后慢注入4%多聚甲醛250ml（大鼠）固定，先后所需50min，多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。然后取材，取完后的脑组织再放置4%多聚甲醛中4度冰箱进行后固定，时间大于2小时，最好过夜。

省时省剂的灌注方法

夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又节省试剂。先灌注生理盐水约100ml（大鼠），见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛，多聚甲醛100ml以下即可。

灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

位置要求：常切的位置有前额叶皮层、纹状体、海马、下丘脑、黑质、小脑

包埋切片：

①如做冰冻切片，先蔗糖脱水，待组织沉底，即可做OCT包埋切片，切片-20℃保存；

②如做石蜡切片，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，切片常温保存，如果后期做免疫实验，封蜡4℃保存；

染色：

脑组织常做的染色及指标：HE、尼氏、LFB 、GFAP、iba-1、NEUN、TH、c-fos。