β-半乳糖苷酶染色实验步骤

β-半乳糖甘酶染色实验原理及步骤

实验原理    细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时衰老相关β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色。绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老(senescence)状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化(aging)的一种潜在原因。染色中以X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下，半乳糖苷键被水解生成深蓝色产物，光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。

β-半乳糖甘酶染色实验步骤：

（1）细胞爬片：

1.固定：对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟；

2.洗涤： 吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟；

3.加工作液:每孔加入1毫升染色工作液； 37℃孵育过夜，可以用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行；

4.水洗、封片：吸掉工作液，加入70%酒精洗2min，然后用PBS洗3min，甘油封片。

（2）组织切片：

1.  对于冷冻切片，直接按照以下步骤进行。

2.  加入适当体积的β-Gal 固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于15min。 

3.  用 PBS 浸泡洗涤组织3次，每次不少于5min。 

4. 按照比例配置染色工作液。吸除β-Gal 清洗液，加入适当量的染色工作液。

5. 37℃孵育过夜。建议使用湿盒或把整个切片浸泡在染色工作液中。

6. 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察，可使用水性明胶封片剂封片保存。

染色结果判读：衰老细胞呈深蓝色。

注意事项：

1. β-Gal  固定液有一定的腐蚀性和毒性，操作时请注意防护。

2. β -半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH 条件，不能在二氧化碳培养箱中进行染色反应。用于细胞培 养的二氧化碳培养箱中较高浓度的二氧化碳会影响染色工作液的pH 值，而导致染色失败。

3. X-Gal溶液在-20℃或4℃保存会冻结，37℃恒温箱或水浴锅处理2-5分钟并适当摇动即可完全融解，刚刚溶解时可能观察到有沉淀，属正常现象，恢复室温充分混匀后，沉淀会全部溶解，建议充分混匀后使用。

4.  爬片或涂片如需长期保存可染色后蒸馏水洗2次，倾去多余液体晾干后中性树胶封片。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

结果展示：