组织、细胞tunel检测

一、TUNEL染色实验原理

实验原理  TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、石蜡切片TUNEL染色实验步骤

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-无水乙醇Ⅰ 6min-无水乙醇Ⅱ6min-95%酒精 6min-85%酒精 6min-75%酒精 5min-流水冲洗；

2.通透：用20ug/ml的Proteinase K工作液处理组织15min或者细胞爬片加细胞通透液0.3% TritonX-100 15min；

3.漂洗：PBS漂洗2次；每次8min；

4.灭活：0.3%甲醇过氧化氢灭活15min；PBS漂洗2次；每次8min；

5.封闭：5%BSA室温封闭1h；

6.制备TUNEL反应液：制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，后面步骤同处理组。

7.滴加TUNEL反应液：玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

8.漂洗：PBS漂洗3次，每次8min；

9.镜下观察：可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；DAPI复染核，PBS漂洗3次，每次8min；抗荧光淬灭剂封片。

10.(白光tunel）滴加POD:（白光tunel）玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

11.漂洗：PBS漂洗3次，每次8min；

12.DAB反应：在组织处加50~100μl DAB底物，镜下观察；

13.漂洗：PBS漂洗3次；

14.苏木素复染：拍照后再用苏木素复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15.拍照时可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）

对于培养细胞的预处理：

①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；

②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；

③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛中固定25min；

④PBS浸洗二次，每次5min；

⑤将吸附细胞的载玻片在0.3%的Triton X-100中处理5min；

⑥PBS浸洗二次，每次5min；

后续操作如同石蜡包埋切片的6-15。

三、染色结果判读：1.白光tunel（加pod）阳性结果棕色；

2.荧光tunel：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为绿色。

结果展示：