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发布日期:2023/6/1 8:49:00来源:http://www.sxyksw.com/news945386.html
骨组织切片重要的前处理——脱钙
在病理科的日常工作中就出会收到带有骨头的病理组织标本,这种标本由于含有大量的磷酸钙和碳酸钙,一般非常的硬,如果不能做好前期处理,对我们的HE制片会造成不小的影响,如切片破损、刀痕严重等问题,那么怎样处理带有骨头的病理组织标本呢?这个时候就需要进行我们病理学中很常见的步骤了,就是组织脱钙,对于骨组织来说,脱钙是关键的步骤,能不能制出好的切片以及后期染色如何,全看这一步了。
脱钙前的固定
通常情况下,组织中如果含有骨、软骨等在HE制片钱都是要经过脱钙才处理的。首先,骨组织固定时间要适当,至少要达到24h,但不得不超过48h。固定时间过短或过长都不行,固定时间太久会严重影响抗原,后续做免疫组化试验很可能出现假阴性。固定时间 太短切片会泛红,看起来很奇怪。由于很多实验室并非恒温实验室,但是固定时间又很长,因此建议放入4℃冰箱中固定,保持低温而稳定的环境,效果会比较好。
脱钙试剂的选择
1)常用的脱钙液有无机酸、有机酸、混合酸以及电解脱钙液等。10%-50%的甲酸水溶液是常用的有机酸。脱钙时间由甲酸的浓度而定,10%甲酸脱钙需要3天,而50%甲酸脱钙需2天。甲酸浓度越高,脱钙速度越快,但同时也会伤害骨组织,导致组织结构不完整,研究鼻腔这种精细结构时50%甲酸是不可取的。脱钙过程需勤换脱钙液,保持浓度,推荐在4℃冰箱中温和地脱钙。注意,千万不要过度脱钙,否则组织会被酸分解,到时整个组织就烂了。
2)另外一种有机酸是EDTA,即乙二胺四乙酸这是一种接近中性液体,可以螯合骨组织中的钙离子。理论上讲它是完美的科研用脱钙液,可以完美地保存骨组织的抗原性、酶类等,但它的脱钙至少需要2周,长的能到3个月。
3)无机酸一般为硝酸。脱钙强度太大,稍不注意组织就脱烂了,不易控制,一般不推荐使用。室温下,浓度在8%以上的硝酸脱钙,超过2天,组织会有明显缺损。
4)混合酸即有机酸和无机酸混合使用,但是脱钙效果不佳,用的较少。
脱钙后的漂洗
需要注意的是,不管是用无机酸还是有机酸又或者是混合酸,脱钙后都需要使用流水充分漂洗。这一步也非常重要。 如果是鼻腔这种精细的组织,则漂洗6h即可,以免组织吸水后膨胀导致原始位置偏移。 这是好的方法。可以洗去骨组织中残留的酸,从而保证骨组织PH为中性,这是保证后期染色正常的重要步骤。如果没有漂洗干净,后期染色会偏红,蓝色的细胞核也会模糊不清。
脱钙效果的判断
脱钙时间的掌握是制片成功的关键,脱钙时间太短,会造成切片时刀痕严重、切片破碎,脱钙时间过长,又会造成HE染色不佳、免疫组化染色也容易出现假阴性。那么我们该如何判断脱钙效果呢?经济、省事的方法就是使用针灸用的针,如果能轻松戳进骨组织,则代表脱钙完全。如果针身弯曲了还是扎不进去,那就更换新鲜的脱钙液,继续脱钙。
骨组织常做的染色
1.HE染色
HE染色是组织学中基础、使用广泛的染色手段,相信大家对此都不陌生。HE染色可以区分一般的骨组织结构和细胞,但单一的HE染色并不能区分新生骨组织的数量、胶原以及其他细胞状态,大多数都需要配合其他染色技术共同观察骨愈合状态。特别的,现在都需要对新生组织进行量化研究,HE染色显然是不能满足要求的。
2.Masson染色
Masson染色的颜色对比鲜明,可见明显的胶原纤维网(苯胺蓝染色则为蓝色,甲基绿则为绿色),能较好地反映纤维组织的形态。其中,蓝色表示新形成的骨,红色表示成熟的骨组织。
3.番红O-固绿染色
番红O-固绿染色可直观反映关节软骨、软骨下的骨组织结构,嗜碱性的软骨与碱性染料番红 O 结合呈现红色,嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成蓝色,在关节软骨及软骨下骨的形态学研究中受到了欢迎。
4.Trap染色
Trap染色是用于检测骨组织、骨细胞中特征物质的染色,使破骨细胞呈红色,背景呈绿色或蓝色。抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)为破骨细胞的标志酶,特异地分布于破骨细胞中,为破骨细胞所特有,通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。
5.甲苯胺蓝染色
软骨基质对甲苯胺蓝的异染性,是因为软骨基质的主要成分是软骨黏蛋白、多糖物质,而酸性硫酸根与嗜碱性染料有亲和力。此法用于显示新生骨组织钙盐沉积,成骨细胞数目统计,观察软骨退变,软骨细胞坏死钙化,软骨基质裂隙,胶原纤维增生等病理改变。染色结果:软骨和成骨细胞呈蓝紫色,背景呈淡蓝色。
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