ELISA的样本收集与处理

1.血清

血清是最常用于ELISA检测的一类样本，处理也比较简单。

操作过程：用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜，使血清析出（最好将试管或离心管倾斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的析出）。4℃ 1000×g离心20分钟，仔细收集上清。建议将血清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

注意事项：采血过程中应避免溶血，因为红细胞裂解时会释放具有过氧化物酶活性物质，在以HRP为检测酶类的ELISA检测中会出现非特异显色，导致检测结果不准确。同时也应避免细菌污染，因为菌体内可能含有内源性HRP，从而导致检测假阳性出现。

2.血浆

用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本，标本采集后30 min内4℃ 1000×g离心15 min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠或枸橼酸钠等，检测时还应仔细阅读试剂盒说明书，检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。

3.细胞培养上清

取细胞培养上清到离心管，1000×g离心20min，除去细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

4.细胞裂解液

1）吸去培养板内的培养基，用胰酶消化细胞，加适量培养基将细胞从培养板上吹打下来。悬浮细胞可省略此步骤。

2）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培养基，用预冷的PBS洗3次。

3）加入适量的预冷PBS或细胞裂解液（临用前加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。通常6孔板的一个孔的细胞量需要添加150~250 μL PBS或细胞裂解液重悬。

4）将样品放入-20℃或-80℃环境，使样品冷冻，再放室温解冻样品，反复冻融几次，使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎，以达到裂解目的。

5）4℃ 10000×g离心10min，除去细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5.组织匀浆液

1）将组织样本用PBS（0.01M，PH7.4）冲洗，洗去组织表面残留的血渍或杂质。

2）将组织块称重，记录后剪碎，应尽量将组织块剪小，使匀浆更充分。

3）将组织按一定的比例加入预冷的PBS（临用前加入蛋白酶抑制剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按组织重量∶PBS体积=1∶9的比例匀浆，例如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）。

4）吸取匀浆液到离心管，4℃ 5000×g离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

6.尿液、唾液等其他液体生物样本

1000×g离心20min，取上清即可检测。

注意事项：因为ELISA只能检测可溶性蛋白含量，所以应保证所有样本均为澄清的液体，沉淀或悬浮物都应离心去除。