Western Blot实验流程

实验原理

Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤

一 样本制备

1.1蛋白提取：

使用ripa裂解液进行细胞蛋白提取：使用4℃预冷PBS洗净后按照六孔板或者每106细胞加入150ul预冷RIPA裂解液的比例加入裂解液（预先加入蛋白酶抑制剂），轻柔吹打数下以充分裂解细胞，置于冰上（4℃冰箱）孵育裂解10min，后4℃12000rpm离心10min；取上清液为蛋白样品；

1.2蛋白定量

使用BCA法进行操作，操作过程严格按照试剂说明书进行。蛋白样本稀释5倍使得蛋白浓度处于标准曲线线性范围内。说明书参考康为世纪BCA定量试剂盒说明书：https://www.cwbiotech.com/goods/index/id/10069。

1.3蛋白变性

根据BCA定量结果，使用微量移液器吸取40ug蛋白，加入相应体积的RIPA使得所有样本的浓度一致。加入对应体积的5*loadingbuffer，轻轻混合，煮沸100℃变性5分钟，4℃ 12000rpm/min离心10min后4℃备用。

二 电泳转印

2.1制胶

(1) 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm 处）。

(2) 配制分离胶10ml（每块胶需要5ml）。凝胶浓度根据蛋白分子量微调，配方按照试剂盒说明书，快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。

(3) 立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合），室温放置约40min至分离胶凝固（如果室温低于15℃则延长放置时间，最长不用超过2h）。

(4) 配制5%浓缩胶2ml（每块胶配2ml）

(5) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约40 分钟。

(6) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。

2.2电泳

为了让蛋白按照分子量分开而进行。

点样：将样品轻轻加至凝胶孔中

电泳：接通电源，设置电泳仪成稳压状态，将电浓缩胶80V约25min（溴酚蓝跑至分离胶和浓缩胶分界线）；分离胶电压调整为120v大约1h。以溴酚蓝为标志，电泳染料至分离胶3/4处结束电泳。

2.3转印.

凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，使用0.22umPVDF膜作为固相支持物。本实验室采用湿转的转膜方式进行实验。

(1) PVDF膜需要预处理：先置于100%甲醇中浸泡10-15s使得膜变为半透明即可，而后置于电转液平衡备用；NC膜不需要预处理。

(2) 剪裁与胶同样大小的8 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用；

(3) 取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次；

(4) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为8 层滤纸→样品胶→蛋白膜→8层滤纸（注意排除气泡），扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中；

(5) 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。

(6) 400mA转印1h，注意保持转印槽处于较低温度下，可使用冰块包裹转印装置。

三 封闭

3.1 一般使用TBST配制的5%脱脂奶粉室温下摇动1h进行封闭

3 .2封闭完成后使用TBST在摇床上洗膜三次，每次10min

四 抗体孵育

4.1一抗孵育

使用封闭液按照抗体说明书（的比例）稀释一抗。将封闭好的膜放入一抗溶液中。置于4℃摇床摇动过夜孵育后室温孵育1h。一抗孵育完成后使用TBST在摇床上洗膜三次，每次10min。

4.2二抗孵育

洗膜完成后，将膜转移至稀释好的二抗溶液中（使用封闭液按抗体说明书数稀释二抗）。室温孵育1h，完成后使用TBST在摇床上洗膜三次，每次10min。

五 曝光成像

使用赛默飞ECL发光液进行实验。把抗体孵育完成的膜从TBST中取出，吸干液体，放入成像仪中（天能）。将发光液1:1混合后淋在膜上，开始曝光。