免疫组化丨免疫组化步骤及注意事项

免疫组化是基于免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量研究。

免疫组化具有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等多种优点。

免疫组化可应用于确定细胞类型、发现微小转移灶、了解分化程度 、临床应用、肿瘤起源与分化 、指导治疗与预后等多个方面。

一、免疫组化步骤：

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗；

2.抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸（PH6.0)抗原修复液的高压锅内进行抗原修复，喷气计时2.5min， 自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入0.3%甲醇过氧化氢溶液，室温避光孵育 20 min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；

4.BSA 或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用 5%BSA，室温封闭 1h；

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C 孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6. 加生物素二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加生物素偶联的二抗，覆盖组织，室温孵育 50min；

7.加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈内滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，覆盖组织，室温孵育 50min；之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 8min；

8. DAB 显色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min；切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的 DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色， 自来水冲洗切片终止显色；

9. 复染细胞核：Harris 苏木素复染 3min 左右，自来水洗，分化液分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝；

10. 脱水封片：将切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

11. 显微镜镜检，图像采集分析。

染色结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB 显出的阳性表达为棕黄色。

1、组织的固定

组织固定的好坏直接影响免疫组化的结果，选择良好的固定液并及时充分的固定可以防止组织自溶，最大限度保留组织的抗原性，保证免疫组化结果的准确性。

2、组织的脱水

组织脱水不彻底，会出现组织掉片的现象，而且显色效果差，容易混淆诊断。

为保证组织脱水彻底，应制定相应的更换试剂的制度，及时更换并有专人负责，做好相应的记录。

3、切片

玻片选择粘附载玻片，切片不宜厚，推荐厚度3~5μm，可以保证后续修复时最大限度暴露抗原。

切片无皱褶、无气泡，烤片温度设置65~68℃，时间为3小时。

烤片不充分会导致组织脱片影响后续的检测，但烤片也不宜过度，温度过高会加速抗原氧化，导致抗原丢失。

4、抗原修复

热修复包括水煮加热、高压加热和微波加热3种。最常用的抗原修复方法是热压修复。

5、阻断内源酶

进行免疫组化标记的组织，通常含有一定量的内源性酶，由于在免疫组化染色过程中，大部分抗体是用过氧化物酶来标记的。

比如我们通常使用HRP即辣根过氧化物酶标记的二抗，酶起催化作用，促进底物的结合，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，这就影响了免疫组化的特异性。所以在加酶标二抗之前，应先用过氧化氢阻断内源酶，将对后续检测结果的影响降到最低。

6、抗体的选择和使用

选用与使用的一抗同源性的二抗。要选择适宜的一抗，不同的二抗与一抗浓度不匹配，都不能得到满意的结果。

7、显色反应

DAB显色剂须现配现用，切片多时应分次配制，分批显色。根据温度和整体显色情况决定终止反应，一般显色时间3～5min，时间过长致显色过深和背景着色，过短致反应不足或出现假阴性。

由于DAB有一定的毒性，在操作时要特别注意自身的防护，实验器材专用，以防污染。

8、复染

使用苏木素复染5~10s，无需分化，衬染效果较好，与DAB显色形成的褐色沉淀形成分明的对比，便于观察和判读。

9、试剂的保存

因为抗体是蛋白质，保存或使用不当不但会造成浪费，而且变质会出现假阴性结果。

要注意抗体的有效期，对于一次用不完的抗体可保存在冰箱内，而不要放在冷冻室，反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。

同时防止抗体的相互交叉污染和细菌污染。

10、实验环境温度

标准实验室温度是18～22℃，实际工作中却不然，条件差的实验室冬天可低于12℃，夏天可高于37℃，冬夏温差可达到25℃。

一切酶促反应温度最关键，反应程度也是冬夏季有别，这也是造成染色结果不稳定的一个重要原因，因此应该选用37℃恒温箱进行孵育。