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发布日期:2024/6/6 17:50:00来源:http://www.sxyksw.com/news1022819.html
一,背景技术
在实验动物组织病理学实验研究中,特别是进行原位杂交和免疫组化研究,为避免或减少死后组织形态及结构发生变化,常于动物处死前,采用灌注固定法。灌注固定即通过血管途径将固定液导入所需固定的组织器官内,将活的细胞在原位及时迅速固定,再摘取样品。
二,实验原理
心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死之前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象。多聚甲醛使组织蛋白发生交联,以保持蛋白的原位和表面结构不变,从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。
三,实验前准备
实验器具: 剪刀1把,眼科剪1把,镊子1把,0.5ml的注射器1个,大头针4个 (可用针头替代),解剖板1个,止血钳2把,灌注机1整套,止血夹1个,断头台1个,离心管1支,废液缸1个,水合氯醛1瓶,生理盐水1瓶,4%多聚甲醛1瓶。
四,实验步骤
1、老鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)。用镊子扯起胸部皮肤,另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏。
2、将注射针头插入老鼠左心室,同时将老鼠肝脏减掉,以使血液流出。灌注生理盐水,时间维持在 1分钟 (10~20ml) 灌注液左右,血液排除后,四肢、肝脏和舌头会变白。
3、待老鼠四肢、肝脏和舌头变白之后,用 4%PFA 灌流固定当 PFA 流至大脑处可能会使老鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有),此时可将灌流速度下调,以使固定更加充分。整个 PFA 灌流时间约为 5min。(固定原理: 多聚甲醛可以使蛋白质交联)
4、将导管始端从 PFA 中拿出,待管中液体流尽后,将心脏上的针头拔下,如果固定的较好,可发现老鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取其他组织的操作。
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